依據《中藥復方制劑整體質量評價體系的構建及應用》中關于構建中藥復方制劑整體質量評價體系的技術路線，按照《達立通顆粒整體質量研究方案》，開展達立通顆粒整體質量評價研究，包括研發立項研究、組方和方解研究、中藥材/飲片質量研究、生產過程控制技術研究、作用機制研究、質量標志物和生物標志物研究、循證醫學研究、藥物經濟學研究。根據項目進展情況，我們將陸續報道相關研究成果。本期介紹達立通顆粒揮發油GC指紋圖譜研究及GC-MS成分分析研究成果。

摘要：目的  建立達立通顆粒揮發油GC指紋圖譜，并采用GC-MS法進行成分分析。方法  以AgilentHP-5（30m×0.32mm，0.25μm）石英毛細管柱進行分離，進樣量1μL，高純度氮為載氣，流速1.0mL/min，氫火焰離子檢測器（FID）檢測，程序升溫，前進樣口溫度250℃，檢測器溫度280℃，分流比為20：1。建立10批樣品圖譜共有模式，結合化學計量學法分析。通過NIST11.L標準譜庫檢索GC-MS分析成分，并對達立通顆粒揮發油成分進行歸屬。結果  從10批樣品共有圖譜中選取13個共有峰，各成分相似度均大于0.998，樣品可分為3類。通過GC-MS共鑒定出56種成分，包含11個共有峰，并對各共有峰進行歸屬。結論  建立的達立通顆粒揮發油GC指紋圖譜，精密度、重復性與穩定性良好，可為達立通顆粒揮發油質量控制提供參考依據。

關鍵詞：達立通顆粒；揮發油；指紋圖譜；GC-MS

 

中藥揮發油分布廣泛，藥理作用顯著，為中藥研究中不可或缺的一部分。由于揮發油易揮發、成分復雜、含量差異大，揮發油質量受多種因素影響，致使難以控制中藥揮發油及含揮發油制劑質量。達立通顆粒收載于《中國藥典》（2020年版）一部中，該藥清熱解郁、和胃降逆、通利消滯，常用于治療功能性消化不良、功能性胃十二指腸病、反流性胃病等。該藥由十二味中藥組成，其中柴胡、枳實、木香、陳皮中揮發油為主要活性成分，經現代藥理研究可知：柴胡揮發油可解熱、鎮痛；枳實、木香揮發油均存在抑菌、抗潰瘍活性；陳皮揮發油則能有效增強胃腸道消化能力。各揮發油對達立通顆粒療效具有一定作用。

達立通顆粒制備工藝提取了以上四味藥材揮發油，但質量標準中未對揮發油進行定性定量分析，即建立該藥物揮發油指紋圖譜對其質量控制有重要意義。本實驗以GC法建立達立通顆粒揮發油指紋圖譜，評價10批達立通顆粒油圖譜相似度，結合化學計量學法，并采用GC-MS對揮發油成分進行鑒定分析，為各共有峰進行藥材歸屬，可為達立通顆粒揮發油質量控制提供方法及制劑整體質量控制提供更全面參考。

1、儀器與試劑

1.1 儀器

安捷倫7890B氣相色譜儀、安捷倫7890A-5975C氣相質譜儀、AgilentHP-5毛細管柱（30m×0.32mm，0.25μm）（美國安捷倫公司）、SXKW數顯恒溫電熱套（北京永光明醫療儀器有限公司）、0.5μL-10μL移液槍（上海BIO-DL公司）、BS214D型萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）、MS105DL型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）等。

1.2 試劑

達立通顆粒（每袋6g  批號：211139、211140、211128、211243、211246、211249、211250、211251、211252、211253編號：S1～S10）、正己烷（色譜純），購自上海麥克林生物科技有限公司。原藥材：北柴胡（批號：2210219芍花堂國藥股份有限公司）、木香（批號：210101麗江華利生物開發藥業有限公司）、枳實（批號：Q201035產地：江西新干）、陳皮（批號：210107亳州金芍堂中藥飲片有限公司），以上均由南昌弘益藥業有限公司提供，經江西中醫藥大學曹嵐副教授鑒定為正品。對照品：γ-萜品烯（B21981含量≥95%）、芳樟醇（B20387含量≥98%）、β-欖香烯（B23134含量≥98%）、購自上海源葉生物科技有限公司；對傘花烴（COAA-17-D0004491  含量=99.2%）購自上海道垚測試技術有限公司；D-檸檬烯（CDCT-C14634100含量=98.66%），購自美國LGC公司。

1.3 測試溶液制備

1.3.1 供試品溶液

稱取適量達立通顆粒研細，精密稱取細粉100g，置2000mL燒瓶中，加入8倍量超純水，按《中國藥典》（2020年版）四部揮發油測定法（甲法），提取7h，收集的揮發油，采用無水硫酸鈉脫水，放置12h，脫水后揮發油密封轉移至4℃下避光保存。

精密量取揮發油10μL，置2mL容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得。同法制備10批供試品溶液S1～S10。

1.3.2 對照品溶液

分別精密量取各對照品對傘花烴0.75mg、D-檸檬烯1.64mg、γ-萜品烯1.05mg、芳樟醇0.70mg、β-欖香烯0.20mg，置于2mL容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

1.3.3 各藥材揮發油溶液

取木香、枳實、陳皮、北柴胡藥材，用高速粉碎機粉碎，過2號篩后分別稱取160g，置3000mL燒瓶中，按“1.3.1供試品溶液”提取方法提取揮發油，因北柴胡藥材揮發油提取量較少，難以收集，在其揮發油提取器中加入2mL正己烷，相同處理方法脫水保存，配制各藥材揮發油溶液。北柴胡揮發油溶液配制則取脫水后正己烷層，置5mL容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

2、方法與結果

2.1 氣相色譜條件色譜柱：AgilentHP-5毛細管柱（30m×0.32mm，0.25μm）；載氣：氮氣；流速：1.0mL/min；進樣量：1μL；前進樣口溫度：250℃；檢測器：FID；程序升溫：起始溫度40℃；以10℃/min的速率升至90℃，保持2min；以2℃/min的速率升至140℃，保持5min；再以5℃/min速率升至180℃，保持2min；最后以10℃/min升至250℃。檢測器溫度：280℃；分流比：20：1。

2.2 質譜條件色譜柱：AgilentHP-5MS毛細管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；載氣：氦氣；采用EI離子源，電子能量：70ev；參數采集模式：全掃描；溶劑延遲：4min；流速：1.0mL/min；進樣量：1μL；程序升溫條件與“2.1氣相色譜條件”一致，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃；掃描范圍：30～650amu。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度  ?。?/span>編號：S1）達立通顆粒配制供試品溶液，按“2.1項下氣相色譜條件”，連續進樣6次，以7（S）號γ-萜品烯峰為參照峰，分別計算各次共有峰相對保留時間與相對峰面積。計算結果可知，各共有峰相對保留時間≤0.05%，相對峰面積≤1.18%。表示此儀器精密度良好。

2.3.2 重復性  取同一批次（編號：S1）達立通顆粒，平行配制6份供試品溶液。按“2.1項下氣相色譜條件”，以7（S）號γ-萜品烯峰為參照峰，將6份供試品進樣，分別計算各份供試品溶液共有峰相對保留時間與相對峰面積。計算結果可知，各共有峰相對保留時間≤0.17%，相對峰面積≤0.40%。表示此方法重復性良好。

2.3.3 穩定性  ?。?/span>編號：S1）達立通顆粒配制供試品溶液，按“2.1項下氣相色譜條件”分別在0h、2h、4h、8h、12h、24h進樣，以7（S）號γ-萜品烯峰為參照峰，分別計算各次共有峰的相對保留時間和相對峰面積。計算結果可知，各共有峰相對保留時間≤0.22%，相對峰面積≤0.94%。表示此供試品溶液在24h內穩定。

2.4 達立通顆粒揮發油GC指紋圖譜建立

將S1～S10達立通顆粒揮發油氣相色譜圖數據以AIA格式按相應順序導入至“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”中，處理可得批達立通揮發油GC圖譜疊加。設置參照圖譜S1，時間窗寬度0.1min，選擇中位數法，進行多點校正，設置Mark峰匹配，匹配結果確定了13個共有峰，生成對照圖譜，可得10批達立通顆粒批揮發油GC圖譜及對照指紋圖譜疊加圖，單獨顯示對照圖譜，得揮發油GC對照指紋圖譜。通過達立通顆粒揮發油圖譜與混合對照品圖譜對比，鑒定出了5種成分，4號峰為對傘花烴，5號峰為D-檸檬烯，7號峰為γ-萜品烯，10號峰為芳樟醇，11號峰為β-欖香烯。其中7號峰位較高，且峰形良好，可作為參照峰（S）。

2.5 相似度評價

對照指紋圖譜建立后，以其為參照，選擇進行相似度評價。由實驗結果可知，S1～S10各批次達立通顆粒揮發油指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度在0.998～0.999之間，符合相似度計算要求。各共有峰分離度均大于1.5，分離度良好。

2.6 共有峰歸屬

將正己烷溶劑、“1.3.3項下各原藥材溶液”分別按照“2.1項下氣相色譜條件”進樣，記錄各自圖譜?？瞻兹芤号c對照品圖譜、供試品溶液圖譜相比，未在對照品位置、各成分峰位置出現干擾峰，可知空白試劑無干擾。

將北柴胡、陳皮、木香、枳實揮發油與供試品溶液圖譜相對保留時間對比共有峰歸屬：1～7，9～13號峰，來自北柴胡；1～7，9、10、11號峰，來自陳皮；1～13號峰來自枳實；1～7，9～13號峰，來自木香。

2.7 聚類分析

利用選定的13個共有峰峰面積，對10批達立通顆粒進行聚類分析（HCA）。將數據輸入至BMSPSSStatistics21中，數據標準化處理，以ward法，平方Euclidean距離進行計算，建立聚類分析樹狀圖?？傻?，10批達立通顆粒共分為3類，S1、S10、S5、S4為一類，S6、S8、S3為一類，S2、S7、S9為一類。

2.8 主成分分析

運用SIMCA14.1軟件，以選定的13個共有峰峰面積為變量，為10批達立通顆粒揮發油進行主成分分析（PCA）。該模型建立提取得到3個主成分，其特征值均＞1。模型參數中R2X=0.936、Q2=0.616，表明3個主成分可顯示樣品中93.6%的信息，符合模型預測標準，該模型穩定可靠。10批達立通顆?？煞譃?類，與聚類分析結果一致。

2.9 正交偏最小二乘法-判別分析

HCA與PCA均將樣品分為3類，則進一步探究對組間差異影響能力大的成分。在PCA數據基礎上建立正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）模型，進行統計及變量重要性投影（VIP）分析。該模型R2X=0.856、R2Y=0.862、Q2=0.768，置換檢驗中R2=（0.0，0.165）、Q2=（0.0，-0.662），表示符合模型預測標準，未過度擬合，該模型穩定可靠。VIP值越高，則相應成分對組間質量差異影響越大。

3、揮發油GC-MS成分分析

根據以上質譜條件，將制備供試品溶液與各單味藥材揮發油溶液直接進樣，進樣結果經NIST11.L標準譜庫檢索，選取匹配度≥90的匹配數據，若同一物質存在多個匹配度較高成分選項，則選取最高匹配度成分，結合查閱相關文獻資料確定化合物名稱。對分離出的成分進行分析，運用面積歸一化法檢測各成分相對含量。經GC-MS總離子流圖與共有模式指紋圖譜對比，可對共有峰推測：1號峰為（+）-α-蒎烯，2號峰為（-）-β-蒎烯，3號峰為β-月桂烯，4號峰為對傘花烴，5號峰為D-檸檬烯，6號峰為β-羅勒烯，7號峰為γ-萜品烯，9號峰為萜品油烯，10號為芳樟醇，11號峰為β-欖香烯，12號峰為β-石竹烯

4、討論

4.1 提取條件及色譜條件考察

本實驗采用《中國藥典》中揮發油提取法提取供試品揮發油，考察提取時間（5h、7h、9h）、料液比（6：1、8：1、10：1），經實驗篩選：取100g達立通顆粒時，加8倍水，提取7h為最佳提取條件。為得到色譜峰較多且分離度更好得指紋圖譜，通過改變氣相色譜條件進行比較，分流比（10：1、20：1、30：1）、進樣口溫度（250℃、260℃、270℃）、程序升溫條件、溶劑選擇（無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷），最終選定出色譜峰最多，分離度最好的條件。

4.2 相似度分析

基于中藥揮發油特點，本實驗建立了達立通顆粒揮發油GC指紋圖譜，在其生產的10批達立通顆粒中，相似度均≥0.998，說明各批次達立通顆粒揮發油質量較穩定，化學成分整體性特征差異小。揮發油雖性質不穩定，易受熱影響等，只要嚴格把控原藥材生產加工、揮發油提取、制劑工藝等環節，確保各原藥材品種來源一致，工藝中間產物及動態過程可控，制劑質量可溯源，產品質量可做到均一穩定。HCA、PCA結果均將10批達立通顆粒分為3類，OPLS-DA法中根據VIP值得出：5號峰（-）-β-蒎烯、7號峰D-檸檬烯、13號峰可能為導致達立通顆粒揮發油質量差異成分。

4.3 GC-MS成分分析結果

經過NIST11.L標準譜庫匹配結合查找文獻，從揮發油中分析出56種成分，占圖譜中總峰面積的91.79%。其中相對百分含量較高的5種成分（D-檸檬烯、芳樟醇、γ-萜品烯、對傘花烴、β-羅勒烯）在木香、枳實、陳皮、北柴胡各藥材揮發油溶液GC-MS分析中均有出現，為其所共有成分，在各原藥材中含量也相對較高。對達立通顆粒揮發油指紋圖譜中13個共有峰成分進行了初步確認，推測出11個共有峰成分，共有揮發性成分以單萜類、倍半萜類物質居多，其中D-檸檬烯（35.79%）相對百分含量最高為達立通顆粒揮發油主要成分。有文獻報道，D-檸檬烯具有菌、免疫調節多種作用；可通過誘導細胞凋亡及抑制細胞周期產生抗癌活性，并在治療胃腸道疾病中發揮抗炎鎮痛及胃保護功效。本實驗所建立的達立通顆粒揮發油GC指紋圖譜，方法簡便，結果可靠，結合化學計量學法互為補充，為揮發油在達立通顆粒中質量控制提供理論依據。并對化學成分進行分析與歸屬，推測出56種成分，為進一步探究達立通顆粒揮發油藥效成分及來源提供參考。

 

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