依據《中藥復方制劑整體質量評價體系的構建及應用》中關于構建中藥復方制劑整體質量評價體系的技術路線，按照《達立通顆粒整體質量研究方案》，開展達立通顆粒整體質量評價研究，包括研發立項研究、組方和方解研究、中藥材/飲片質量研究、生產過程控制技術研究、作用機制研究、質量標志物和生物標志物研究、循證醫學研究、藥物經濟學研究。根據項目進展情況，我們將陸續報道相關研究成果。本期介紹達立通顆粒中延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯的測定及在大鼠體內藥代動力學研究成果。

一、摘要

1、目的

研究達立通給藥后大鼠體內主要藥物成分及藥代動力學特點。

2、方法

建立同時檢測延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）方法，應用于測定大鼠血漿和組織中藥物濃度及藥代動力學特征。

3、結果

建立了同時定量測定延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯方法，單次ig給予達立通浸膏后，延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯可以快速吸收進入體內，在血中峰濃度（Cmax）分別為（13.73±7.50）、（27.01±17.69）、（66.73±29.94）ng/mL，曲線下面積（AUC0-t）分別為（80.43±40.03）、（41.30±28.69）、（303.90±136.69）ng·h/mL，消除半衰期（T1/2）分別為（5.82±2.22）、（1.08±0.01）、（4.95±2.53）h。多次給藥能明顯增加各物質體內暴露水平。三種成分在大鼠的主要組織/器官中廣泛分布，在胃腸道中暴露水平最高，其次是肝和腎。三種成分存在明顯的雌雄差異，在雌性大鼠中的暴露量（C_max和AUC）均顯著高于雄性大鼠（p<0.05）。

4、結論

UPLC-MS/MS測定延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯的方法準確、靈敏、可靠。達立通顆粒中胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯可吸收進入血液、廣泛分布于體內組織、器官、較快代謝/消除，為達立通顆粒潛在的體內藥代標記物。

二、引言

功能性消化不良（Functional dyspepsia，FD）是臨床中最常見的一種功能性胃腸道疾病。FD全球總發病率約為16%，但因不同國家或者對于其定義標準不同，該指數稍有變動。根據羅馬Ⅳ標準，功能性消化不良是發生在胃和十二指腸的一系列癥狀，包括上腹痛、飽脹、早飽、噯氣、食欲不振、惡心、嘔吐等不適癥狀，經檢查排除引起上述癥狀的器質性疾病的一組臨床綜合征，可單獨或以一組癥狀出現。其主要分為三種亞型，餐后窘迫綜合征（Postprandial distress syndrome，PDS）、上腹痛綜合征（Epigastric pain syndrome，EPS）和重疊型（PDS-EPS重疊綜合征）。PDS主要表現為餐后飽脹或早飽，主要由胃腸道運動不足引起，而EPS表現為上腹痛或灼燒感，主要由內臟高敏感引起。

由于FD的發病機制復雜，目前尚無標準治療方法。目前治療FD的常規藥物包括質子泵抑制劑（PPIs）、促動力藥和三環類抗抑郁藥（TCAs）。這些藥物僅針對主要癥狀治療，因此大多數療效不佳。并且，尚未有一種治療方法和藥物能夠長期改善FD患者的癥狀。中藥由于具有多組分和多靶點的特征，在FD的治療中逐漸受到青睞，有研究表明，有高達50%的FD患者嘗試針灸和中藥等替代療法。

達立通顆粒是由柴胡、枳實、木香、陳皮、清半夏、蒲公英、焦山楂、焦檳榔、雞矢藤、黨參、延胡索、六神曲（炒）十二味中藥組成，主要用于運動障礙型功能性消化不良，在臨床上對功能性消化不良有良好的療效。實驗室前期研究表明，SD大鼠ig給藥達立通顆粒提取物，體內可檢測出147種化合物，其中22種化合物可以入血，包括生物堿類延胡索乙素、黃酮類川陳皮素和萜類木香烴內酯等。研究表明，這些化合物具有較好的鎮痛、緩解炎癥和改善胃腸道功能障礙等藥理作用。因此，我們認為這些化合物可能是達立通顆粒能有效治療功能性消化不良的潛在藥效物質。十分有必要開發這些化合物的定量檢測方法。

本研究建立并全面考證了SD大鼠ig給藥達立通浸膏后血漿中延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯的UPLC-MS/MS共檢測方法，并應用于不同性別SD大鼠的藥代動力學和組織分布研究。為達立通顆粒治療功能性消化不良提供了臨床指導。

三、材料

1、儀器

AB Sciex 5500+三重四級桿質譜儀；ExionLC二元泵（AB SCIEX，美國）；ExionLC 自動進樣器（AB SCIEX，美國）；ExionLC柱溫箱（AB SCIEX，美國）；Milli-Q Gradient A10超純水機（Millipore，德國）；Sovall Biofuge Stratos 低溫高速離心機（Thermofisher Scientific，美國）。

2、試劑

乙腈（色譜級）購自美國TEDIA公司，甲醇（色譜級）購自德國Merck公司，甲酸（LC-MS級）購自美國Thermo Fisher公司。內標氯苯丙氨酸購自美國Sigma公司，對照品延胡索乙素（Tetrahydropalmatine）（批號：Y21S7Y17091）、川陳皮素（Nobiletin）（批號：G13D11L134229）和木香烴內酯（Costunolide）（J22GB152180）均購自上海源葉生物科技有限公司。以上對照品質量分數均大于98.0%。達立通顆粒浸膏（DLT）（1g浸膏含3.6g生藥，經LC-MS/MS測定，含延胡索乙素51.05μg/g，川陳皮素148.05μg/g，木香烴內酯14.35μg/g）（批號：J210522）由南昌弘益藥業有限公司提供。實驗過程中所用其余試劑均采用市售分析純，實驗用水由實驗室的超純水機（MiLLi-Q Gradient A10）制備。

3、實驗動物

SPF級SD大鼠（雌性各半，220g～250g），購于浙江維通利華有限公司。實驗動物生產許可證號為SCXK（浙）2019-0001。所有動物均飼養于中國藥科大學動物實驗中心，期間給予標準飼料及飲用水，室溫保持在（23±2）℃，相對濕度為（50±15）％，12h晝夜交替。所有動物均在新的環境中適應7天。

四、方法

1、試驗條件

色譜條件：色譜柱：Waters XSelect? HSS T3 柱（3.5μm 4.6×100mm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～1min，3%B；1～2.5min，3～90% B；2.5～6min，90%；6～7min，90～3%B；7～8min，3%B），每針進樣前均平衡3min。流速：0.7ml/min；柱溫：40℃；進樣量：10μL。

質譜條件：點電噴霧離子（ESI）源，正離子檢測模式；多反應監測（MRM）數據采集模式；輔助氣體1（Ion Source Gas 1，GS1，N2），55Arb；輔助氣體2（Ion Source Gas 2，GS2，N2），60Arb；輔助氣溫度（Temperature，TEM），550℃；氣簾氣（Curtain Gas，CUR，N2），40Arb；碰撞氣（Collision Gas，CAD，N2），10Arb；入口電壓（Entrance Potential/EP）：10V；出口電壓（Collision Cell Exit Potential，CXP）：15V。分別對待測物進行離子對優化。

2、主要溶液的配制

（1）延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯及氯苯丙氨酸（IS）儲備液的制備

精密稱取延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯對照品各10mg，分別轉至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，充分顛倒將其混勻，配制成終濃度為1.0mg/mL的儲備液，保存在-20°C備用。

（2）氯苯丙氨酸（IS）儲備液的制備

精密稱取氯苯丙氨酸對照品0.01045g，轉移至容量瓶（10mL）中，用甲醇定容至刻度線，上下顛倒將其充分搖勻，配制成終濃度為1.0mg/mL的內標儲備液，4℃存備用。

（3）蛋白沉淀劑的制備

取內標（IS）儲備液（1.0mg/mL）50μL，加入950μL甲醇稀釋至濃度為50μg/mL，之后取1mL內標溶液（50μg/mL）置于1000mL帶蓋玻璃試劑瓶中，加入1000mL甲醇至試劑瓶刻度線位置，充分混勻，得到含內標（50ng/mL）的甲醇溶液，將該甲醇溶液用作生物樣品處理過程中的蛋白沉淀劑，4℃儲存備用。

（4）標曲工作液及質量控制（QC）工作液的制備

取延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯儲備液，用甲醇稀釋為一系列濃度的混標工作液?；鞓酥泻雍饕宜貪舛葹椋?/span>25、50、100、200、500、1000、2000、5000ng/mL；含川陳皮素和木香烴內酯濃度為：50、100、200、500、2000、5000、10000ng/mL。此外，從重新制備的新的儲備液中分別稀釋成高濃度質控HQC工作液（含延胡索乙素：4000ng/mL，川陳皮素和木香烴內酯：8000ng/mL），中濃度質控MQC工作液（含延胡索乙素：1000ng/mL，川陳皮素和木香烴內酯：2000ng/mL）和低濃度質控LQC工作液（含延胡索乙素：500ng/mL，川陳皮素和木香烴內酯：1000ng/mL）。

（5）給藥溶液的制備

取達立通顆粒浸膏，精密稱定質量，加入一定量的超純水，分別配制成0.32g/mL和0.64g/mL的達立通顆粒浸膏水溶液（DLT）?，F配現用。

3、生物樣品的處理

取大鼠血漿或組織勻漿液（稱取0.1g組織，剪碎后，加入500μL生理鹽水高速組織勻漿器處理為0.2g/mL的組織勻漿液）50μL，以1：4的比例加入蛋白沉淀劑200μL，振蕩（1800r/min，5min），兩次離心（18000r/min，5min，4℃）后，轉移上清液60μL至進樣瓶中進樣分析。

4、方法學考證

該方法的特異性、線性、精密度和準確度、提取回收率、基質效應、穩定性和殘留效應均按照美國FDA生物分析方法驗證指南進行驗證。

（1）專屬性

取六只不同來源的SD大鼠的空白血漿、含對照品（MQC）空白血漿以及ig.DLT后血漿樣品分別按“生物樣品的處理”項處理，LC-MS/MS進樣分析得到典型色譜圖。

（2）標準曲線和定量下限

取空白SD大鼠血漿樣品若干份，每份45μL，分別加入5μL含有延胡索乙素、川陳皮素與木香烴內酯的系列混合工作液，充分混勻后配置成含有川陳皮素終濃度為2.5、5、10、20、50、100、200、500ng/mL，含有川陳皮素和木香烴內酯終濃度均為5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mL的標準生物樣品。按照“2.3”項下方法進行樣品前處理后LC-MS/MS進樣分析，以測得生物樣品中延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯的理論終濃度為自變量（x），延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯的峰面積與內標的峰面積的比值為因變量（y），進行回歸運算（權重系數，W：1/x或1/x2），得到所檢測物質在生物樣品中的線性回歸方程。線性范圍中最低濃度點為定量下限（S/N>10）。

（3）精密度與準確度

通過分析質控樣品在同一天內和連續三天分別分析三批質控樣品來評估精密度和準確度。每批平行制備5個樣品，根據每個批次的標準曲線計算其濃度。日內和日間精密度（RSD）不應超過15%，準確度（RE）應在±15%以內。

（4）提取回收率和基質效應

提取回收率是衡量樣品制備的提取效率，通過提取樣品的峰面積和提取后再加標樣品的峰面積比來衡量提取回收率。

基質效應是通過提取后加標樣品與加有相同濃度待測物的水溶液的峰面積比來衡量。各組處理方式均平行制備3個濃度水平的5份樣品。

（5）穩定性

在以下儲存條件下，通過分析3個濃度水平的質控樣品，每個濃度樣品平行制備5份，對各待測物穩定性進行了評估：室溫下放置6小時；處理后的樣品在4℃進樣盤中放置12小時，處理后樣品在-20℃下儲存24小時；經過三次凍融循環（-70℃到室溫），在-70℃下儲存7天。當準確度偏差在標準濃度的±15%以內時，則認為該待測物在基質中穩定。

（6）殘留效應

殘留效應是通過在定量上限（ULOQ）樣品后進樣空白樣品，空白樣品中的待測物峰面積應小于定量下限（LLOQ）的峰面積的20%。

5、藥物代謝動力學和組織分布研究

（1）藥物代謝動力學研究

單劑量給藥組：取12只SD大鼠（雌雄各半），禁食不禁水12小時后，ig達立通顆粒浸膏水溶液，給藥劑量為6.4g/kg。在給藥前（0 h）和給藥后0.083、0.25、0.75、1、2、4、6、8和12h，從每只大鼠的眼眶靜脈采集血樣（約200μL），然后立即以8000r/min離心5分鐘，將上清血漿轉移到干凈的試管中。

多劑量給藥組：為連續七天ig達立通顆粒浸膏水溶液，給藥劑量為3.2g/kg，采集末次給藥前（0 h）和給藥后0.083、0.25、0.75、1、2、4、6、8和12h的全血，離心分離血漿。根據“生物樣品的處理”項樣品處理方法盡快處理樣品，進樣分析。

（2）組織分布研究

取SD大鼠24只，隨機分成四組（4個時間點，每個時間點6只，雌雄各半），將四組受試大鼠禁食12h后，ig達立通顆粒浸膏水溶液（3.2g/kg），分別于給藥后15min、45min、4h、12h由股動脈放血處死受試大鼠，接取200μL大鼠靜脈血（采血管預先加入5%肝素抗凝），并立即取腦、肌肉、脂肪、性腺、脾臟、腎臟、胃、腸（十二指腸、結腸）、肝臟、肺臟、心臟和胸腺組織。其中腦組織用吸水紙擦去表層毛細血管，心臟、腎臟等組織需剖開沖凈淤血，胃、腸等組織需剖開洗凈內容物，肝臟組織直接剪取肝大葉。按“生物樣品的處理”項樣品處理方法盡快處理樣品，進樣分析。

6、數據分析

采用WinNonlin 6.4軟件（Phoenix 64，Build 6.4.0.768）中的非房室模型（Noncompartment analysis，NCA）分別擬合3種待測物在SD大鼠體內的藥代動力學參數：Cmax（灌胃給藥后血漿藥物濃度峰值）；Tmax（灌胃給藥后達峰時間；AUC0–t（0 h到12 h的血藥濃度-時間曲線下面積）；AUC0-∞（0 h到無限大時間的血藥濃度-時間曲線下面積）；T1/2（消除相半衰期）。結果用Mean±SD表示。應用GraphPad Prism 8中的T檢驗進行組間差異分析，P＜0.05認為具有顯著性差異。

五、結果

1、專屬性

根據保留時間和MRM來確定待測物的色譜峰。三種待測物和IS在保留時間處沒有內源性物質干擾。

2、標準曲線和定量下限

延胡索乙素在2.5ng/mL～500ng/mL的線性范圍內線性良好，川陳皮素和木香烴內酯線性范圍為5.0ng/mL～1000ng/mL。延胡索乙素定量下限為2.5ng/mL，川陳皮素和木香烴內酯的定量下限為5.0ng/mL。

3、精密度、準確度、提取回收率和基質效應

各待測物的精密度、準確度均在可接受范圍內。延胡索乙素的提取回收率和基質效應在可接受范圍內，而川陳皮素基質效應為“130.61%～142.94%”，說明可能存在基質增強作用。而木香烴內酯的提取回收率為“65.83～77.87%”間，在可接受范圍。

4、穩定性

不同實驗條件下的穩定性數據匯總分析結果表明，延胡索乙素在不同條件下均穩定。而川陳皮素在-70℃下儲存7天后，其濃度下降了41.05%，在其他條件下穩定。在室溫下放置6小時后，木香烴內酯的濃度下降了95.71%，而在-70℃下儲存7天后，濃度下降了28%。但按上述“生物樣品的處理”方法處理后，無論在4℃還是-20℃保存，其濃度都保持穩定。

5、殘留效應

空白樣品中各待測物的峰面積均低于定量下限的20%，證實該分析方法無明顯殘留。

6、藥物代謝動力學和組織分布研究

單次ig達立通顆粒浸膏水溶液（6.4g/kg）后45min的血漿樣品中的延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯的Tmax分別為（1.40±0.93）、（0.63±0.28）、（2.38±8.81）h，Cmax分別為（13.73±7.50）、（27.01±17.69）、（66.73±29.94）ng/mL，AUC0-t分別為（80.43±40.03）、（41.30±28.69）、（303.90±136.69），T1/2分別為（5.82±2.22）、（1.08±0.01）、4.95±2.53）h。

多次ig達立通顆粒浸膏水溶液（3.2g/kg）后，延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯的Tmax分別（1.08±0.59）、（0.67±0.19）、（2.30±2.75）h，Cmax分別為（19.77±10.81）、（24.58±12.17）、（41.93±30.10）ng/mL；T1/2分別為（5.48±1.09）、（0.46±0.00）、（5.64±2.02）h，AUC0-t為（106.00±64.90）、（24.58±12.17）、（210.57±117.89）ng·h/mL。盡管多次給藥的給藥劑量（3.2g/kg）為單次給藥（6.4g/kg）的一半，但多次給藥后，各待測物的Tmax、T1/2相近，Cmax、AUC與單次給藥無明顯差異，說明多次給藥后，能夠明顯增加各物質在大鼠體內的暴露量，但不影響其吸收和代謝速度。

無論是在單次ig給藥還是多次ig給藥后，雌雄大鼠各待測物的藥代動力學參數都存在明顯差異。雌性大鼠的C_max和AUC_0-t、AUC_0-∞均顯著高于雄性大鼠（p<0.05），表明雌性大鼠中各待測物的暴露量明顯高于雄性大鼠。此外，單次ig給藥后延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯三種待測物的T1/2都小于8小時，表明各待測物在大鼠體內快速消除，未見明顯蓄積。單劑量ig達立通顆粒浸膏水溶液后，延胡索乙素的T_max在雌性大鼠中小于雄性大鼠，說明延胡索乙素在雌性大鼠中比在雄性大鼠中吸收得更快。T_1/2相近，說明消除速率不存在差異。川陳皮素的暴露量很低，只在雌性大鼠中檢測到。雌性大鼠血藥濃度達到峰值的時間相對較快。另外值得注意的是，木香烴內酯分別在0.25h～0.75h和6h～8h左右觀察到雙吸收峰。

SD大鼠單次ig 3.2g/kg達立通顆粒浸膏水溶液后，三種待測物在大多數組織廣泛分布，其中大部分在15分鐘和45分鐘達到最高濃度，12小時后各待測物在大多數組織中基本消除。延胡索乙素在胃、腸和肝臟的分布濃度最高，其次是脂肪分布濃度，在結腸、心臟、腦、腎和其他組織的分布濃度相對較低。川陳皮素主要分布在腸道和胃，其次是腎臟，其他組織的分布濃度較低，大部分在4 小時后完全消除。木香烴內酯的分布濃度在胃和小腸中較高，其次是在結腸、肝和脾中的分布濃度。木香烴內酯的大部分組織分布濃度在15分鐘時達到最高后隨時間的推移逐漸降低。但在結腸組織中隨時間增加，12小時木香烴內酯的分布濃度較高，表明該物質可能在多個腸段被吸收，這可能解釋了血漿濃度時間曲線中的雙峰現象。延胡索乙素和木香烴內酯也高度分布在肝臟中，表明它們可能主要通過肝臟代謝消除，而川陳皮素在腎臟張分布較高，可能通過腎臟代謝消除。

通過比較雄性和雌性大鼠ig達立通顆粒浸膏水溶液的后的組織分布情況，結果表明，雌性大鼠的總體組織分布濃度略高于雄性大鼠。此外，在大多數組織中，各分析物在雌性大鼠的組織分布濃度在15min時最高，而在雄性大鼠中延遲至45min，這表明各分析物的吸收和分布在雌性大鼠中較快。

六、討論

達立通顆粒在臨床上對功能性消化不良具有很好藥效，但其體內主要藥效成分和藥效物質基礎不夠明確。為闡明此問題，在前期我們研究并鑒定體內存在成分的基礎上，本研究建立并考證了一種快速的、具有較高選擇性和可重復性的UPLC-MS/MS定量檢測方法，用于同時測定大鼠血漿中的延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯。研究發現木香烴內酯提取效率低于80%，文獻認為可能是由于木香烴內酯具有較高的血漿蛋白結合率。在木香烴內酯的穩定性考察中，發現木香烴內酯在血漿中不夠穩定，考慮血清酯酶是降解的主要因素，控制血清酯酶活性，避免木香烴內酯中的酯鍵水解具有積極意義。事實上，我們發現樣品采集后應盡快采用有機溶劑處理，再保存于4℃或者-20℃，或先在-70℃下，可以大幅減少降解比例。

本文建立的UPLC-MS/MS定量檢測方法成功應用于達立通顆粒浸膏的藥代動力學和組織分布研究。結果表明延胡索乙素、川陳皮素和木香烴內酯在大鼠體內的吸收、分布和代謝較為迅速，三種待測物在不同性別大鼠體內的藥代動力學特征在ig給藥后存在顯著差異。川陳皮素的暴露量很低，只在雌性大鼠中檢測到。雌性大鼠血藥濃度達到峰值的時間相對較快，Tmax和T1/2等參數與前人研究結果接近。與單次較高劑量（6.4g/kg）給藥相比，較低劑量（3.2g/kg）多次給藥后，三種物質的體內暴露水平相當，提示多次給藥能明顯提高藥物成分體內濃度，有利于達立通顆粒藥效作用的發揮。

值得注意的是，與其他研究結果相似，木香烴內酯的藥代動力學曲線顯示明顯的雙峰現象，有學者提出木香烴內酯的雙吸收峰是由腸肝循環造成的，考慮到木香烴內酯在腸肝循環過程中，在血清酯酶和肝臟豐富酶系的代謝下難以存在大量的（代謝）逃逸，而達立通顆粒浸膏中存在多種木香烴內酯類似物，存在體內代謝轉換，導致木香烴內酯類吸收達峰和代謝轉化生成達峰二個高點。另外與Zi-Wei Yu等人的研究發現給藥木香烴內酯和去氫木香烴內酯混懸液（62.9mg/kg）30分鐘后可以在結腸組織中檢測到較高的組織分布濃度結果有所不同，我們測定結果顯示給藥后的45分鐘之內，結腸組織未檢測到木香烴內酯，只有4小時后結腸部分才出現木香烴內酯。提示此時木香烴內酯可以在結腸組織被吸收并形成二次濃度高點。

 

本人僅供專業人士參考。

本文綜合整理自南昌弘益藥物研發團隊，歡迎轉發，禁止轉載，轉載授權請聯系0791-88161315。